LECTURA DE TINCIONES EN SANGRE PERIFÉRICA (PRONÓSTICO RÁPIDO Y REALIZACIÓN DE UN FROTIS DE SANGRE PERIFÉRICA CAPILAR) PANÓPTICO RÁPIDO.
OBJETIVOS: Realizar tinciones para colorear diversas estructuras de las células sanguíneas aumentando el contraste entre ellas y el medio que las rodea.
UTILIDAD CLÍNICA: Identificación de los distintos tipos celulares al microscopio y poder obtener rápido y conseguir realizar una ejecución con mayor rapidez. Esta tinción es muy utilizada en los pronósticos de urgencia.
FUNDAMENTOS: Se basa en la tinción de May Grünwald, Giemsa y Wright.
MATERIALES:
-Un par de portaobjetos ( o unos cuantos mas por si nos sale mal) -Muestra sanguínea -Capilar o pipeta pasteur (para coger la muestra) -Alcohol/acetona (para desengrasar los portaobjetos)
REACTIVOS: -Solución fijadora a base de Metanol.
-Colorante ácido tamponado normalmente un derivado de eosina en tampón fosfato.
-Un colorante básico tamponado derivado del azul de metileno.
PROCEDIMIENTO:
1. Lavamos los portas en una disolución acuosa con alcohol para eliminar la grasa que llevan y dejamos secar.
2. Nos desinfectamos las manos y nos pinchamos con una lanzeta.
3. Una vez que nos hemos pinchado recogemos la sangre con un capilar y colocamos una gota en el porta.
4. Con otro porta realizamos la extensión y dejamos secar.
5. Metemos el porta con nuestra extensión en 3 colorantes.
Primero, en una solución fijadora de metanol, segundo, en ácido tamponado de eosina y tercero, en disolvente de azúl de metileno.
6. Lavamos con agua destiada y dejamos secar.Vamos escurriendo el exceso de cada reactivo con papel filtro.
Dejamos entre 5-10 segundos el porta sumergido en cada colorante.
PRÁCTICA Nº2 16/10/2017
TINCIONES CONVENCIONALES SUPRAVITALES. TINCIÓN DE RETICULOCITOS.
OBJETIVOS:
Vamos a observar los reticulocitos que son hematíes inmaduros que aun conservan algunos orgánulos celulares.
UTILIDAD CLÍNICA:
Con esta tincion los hematíes se tiñen de color verde pálido y los reticulocitos se diferencian porque en su interior se observan estructuras granulares o filamentosas de color azul.
FUNDAMENTOS:
Las tinciones supravitales son tinciones diseñadas para la observación de células vivas, por tanto no requieren una fijación previa.
En este tipo de tinciones, primero se realiza la tincion, mezclando el colorante con la sangre y después se realiza la extensión sobre un portaobjetos para poder visualizar el resultado al microscopio.
La tincion supravital mas habitual para las extensiones de sangre periférica es la tincion de azul cresil brillante para reticulocitos.
APARATAJE:
No se utiliza ningun aparato.
MATERIALES:
-Sangre periférica anticuagulada con EDTA.
-Tubos de ensayo.
-Pipetas.
-Portaobjetos.
REACTIVOS:
-Solución colorante.
PROCEDIMIENTO:
-Introducir en un tubo de hemolisis, cantidades iguales de solución colorante y de sangre periférica anticuagulada con EDTA.
-Mezclar suavemente y cerrar el tubo con parafilm para evitar la desecación.
-Incubar cinco minutos en baño maría a 37ºC.
-Homogeneizar suavemente la mezcla.
-Depositar una gota sobre un portaobjetos limpio y realizar una extensión, que se deja secar al aire.
RESULTADOS:
OBSERVACIONES:
-El portaobjetos debe estar desengrasado antes de utilizarlo.
PRÁCTICA Nº3 16/10/2017
TINCION MAY-GRÜNWALD GIEMSA
FUNDAMENTO: La tinción de May Grünwald-Giemsa es una de las tinciones policromas más utilizadas en hematología. Se basa en la combinación de dos colorantes que en solución acuosa se ionizan y se combinan con los distintos componentes celulares, según sus respectivas afinidades, generando sales insolubles con diferentes matices de coloración.
May Grünwald: es una solución de eosina y azul de metileno en metanol, que actúa como fijador. El azul de metileno es un colorante básico (catiónico) con afinidad por los componentes celulares ácidos, como los ácidos nucleicos, a los que tiñe de azul. Las estructuras celulares que fijan colorantes básicos se denominan basófilas.
Giemsa: es una mezcla de eosina y derivados del azul de metileno. como el azur I y el azur II. La eosina es un colorante ácido (aniónico) que tiñe de matices de rojo los componentes celulares básicos, como la hemoglobina y otras proteínas básicas y los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos eosinófilos. Las estructuras celulares que fijan los colorantes ácidos se denominan acidófilas, y cuando el colorante que fijan es la eosina, se denominan eosinófilas.
UTILIDAD CLÍNICA: Observar los componentes celulares (neutrófilos, leucocitos...) que reaccionan con ambos tipos de colorantes en distintas proporciones, generando diferentes matices tintoriales pudiendo ser observados con claridad.
MATERIALES:
Pipetas pasteur
Portas (Para realizar una extensión).
Puente de tinción (Para colocar los portas con el colorante mientras escurren).
Agua destilada
Barreño para que los portas escurran su colorante.
REACTIVOS:
Colorantes proporcionados por el kit; Colorante May Grunwald y colorante giemsa.
PROCEDIMIENTO:
1. Nos pinchamos con una lanceta y realizamos una extensión (En mi caso la tuve que repetir porque mis extensiones no estaban bien realizadas).
2. Lavamos los portas que no utilizamos en agua, lejía y jabón y los reutilizamos.
3. Colocamos la extensión en un puente de tinción depositado en un barreño para que el colorante escurra y se elimine.
4. Normalmente los kits comerciales contienen una solución concentrada de May Grünwald en metanol y una solución acuosa (tamponada o no) de Giemsa. Para realizar la tinción hay que diluir ambos colorantes, según cada fabricante. -Colocamos la extensión sobre el cristalizador. -Cubrimos la extensión con solución May Grünwald durante dos minutos (para fijarlo). -Volcamos la extensión para eliminar el colorante y escurrimos. -Cubrimos la extensión con solución diluida de May Grünwald durante un minuto. -Volcamos la extensión para eliminar el colorante, lavamos con agua destilada y escurrimos. -Cubrimos la extensión con solución diluida de Giemsa durante 20 minutos. -Volcamos la extensión para eliminar el colorante, lavamos, escurrimos y dejamos secar al aire.
OBSERVACIONES: Observamos un neutrófilo en el centro.
PRÁCTICA Nº4 16/10/2017
TINCION DE WRIGHT
FUNDAMENTOS: La tinción de Wright es otra de las tinciones que se utilizan de manera rutinaria para teñir frotis de sangre periférica. El fundamento es el mismo que en la tinción de May Grünwald-Giemsa, pero en este caso solo se usa un colorante, que es una mezcla de eosina, azul de metileno y derivados del azul de metileno en metanol.
MATERIALES:
Pipetas pasteur
Frotis sanguíneos
Barras paralelas y cristalizador
Agua destilada
REACTIVOS:
Colorantes proporcionados por el kit
PROCEDIMIENTO:
La tinción se realiza con un colorante pero en dos paso. Primero se incuba con el colorante sin diluir, y luego con una dilución tamponada del mismo colorante.
Colocaremos la extensión en un puente de tinción sobre el cristalizador.
Cubrimos la extensión con colorante de Wright sin diluir durante 5-8 minutos. El metanol fija la extensión y se inicia la tinción de las células.
Volcamos la extensión para eliminar el colorante y escurrimos.
Cubrimos la extensión con una dilución del colorante de Wright en tampón de pH 7,2 durante unos 10-15 minutos. En esta fase se completa la tinción de las estructuras celulares.
Volcamos la extensión para eliminar el colorante, lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire.
Observamos los hematies con el microscopio, añadiendo aceite de inversión con el objetivo 100x.
PRÁCTICA Nº5 23/10/2017
TIPIFICACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO
OBJETIVOS:
Esta técnica se utiliza para determinar el grupo sanguíneo mediante la tipificacion.
UTILIDAD CLÍNICA:
Se utiliza para muchas aplicación como es determinar el grupo ABO.
También se puede utilizar para otros antígenos siempre que se disponga de sus anticuerpos complementarios.
FUNDAMENTOS:
Las técnicas de aglutinación se usa para la detección de antígenos eritrocitarios, son técnicas inmunologicas que se basan en la capacidad que tienen algunos antígenos para unirse a sus anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles a simple vista.
Esto es posible porque las moléculas de anticuerpos tienen varios sitios de unión al anticuerpo, lo que les permite unirse a dos o mas antígenos próximos.
APARATAJE:
No necesita aparatos.
MATERIALES:
-Portaobjetos.
-Sangre anti-coagulada con EDTA.
-Puntas de pipeta.
-Tubos de hemolisis de 3 ml.
REACTIVOS:
-Reactivos Anti-A, Anti-B, Anti-AB, Anti-D, Control D.
PROCEDIMIENTO:
*Para la prueba en porta:
-Se rotulan cinco portas con:
1-A
2-B
3-AB
4-0
5- Control 0.
-Se les añaden los reactivos correspondientes a cada porta.
-Por ultimo se le adiciona una gota de sangre anti-coagulada a cada porta y se mezcla con una punta de pipeta.
*Para la prueba en tubo:
-Se hace exactamente igual que en porta pero con tubos.
RESULTADOS:
Se trata del grupo B-, porque ha aglutinado en el porta B y es negativo por que en el porta O no ha aglutinado.
OBSERVACIONES:
-Al porta se le aplica un suave movimiento de rotación durante un minuto para que reaccione con los reactivos y se forme la aglutinación.
PRÁCTICA Nº6 25/10/2017
DETERMINACIÓN CELULAR DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS ABO Y RH EN TUBO.
OBJETIVOS:
Determinar los grupos sanguíneos del sistema ABO, determinar el Rh ( ag D) y observar la presencia de aglutinación en el tubo.
UTILIDAD CLINICA:
FUNDAMENTOS:
APARATAJE:
Centrifuga
MATERIALES:
-Gradilla, para-film.
-Tubos de hemolisis.
-Micropipeta automática y puntas de pipeta.
-Sangre anti-coagulada.
REACTIVOS:
-SF.
-Anti-A, Anti-B, Anti-AB, Anti-D, Autocontrol RH.
PROCEDIMIENTO:
-Se realiza una suspension de hematies al 5%. Para ello se prepara para toda la clase en un vaso de precipitado 7,5 ml de sangre anticoagulada con 92,5 ml de Suero Salino. Y se reparte 6,7 ml para cada grupo.
-El tubo con los 6,7 ml de la mezcla de centrifuga.
-Una vez centrifugado se quita el sobrenadante y se le añade 1,9 ml de SF y se vuelve a lavar asi hasta 3 veces.
-Por otro lado, se rotulan 5 tubos con el nombre A, B, AB, O, CD.
-Se depositan en los tubos 4 gotas de la mezcla anteriormente centrifugada y 4 gotas del reactivo correspondiente en cada tubo.
-Esperamos 2 minutos para observar las reacciones de aglutinacion resultantes.
RESULTADOS:
Aunque no se puede apreciar muy bien en la imagen en resultado es A +.
OBSERVACIONES:
-Termostatizar los reactivos a temperatura ambiente.
-Realizar un lavado de hematíes para evitar interferencias que puedan ocasionar falsos resultados.
-En el caso de que el tubo para la determinación del AG D de resultado negativo en un primer momento, incubar durante 15 min en baño termostatizado y volver a observar la presencia o ausencia de aglutinación. Si después de esto vuelve a dar negativo, entonces se considerará Rh-.
PRÁCTICA Nº7 13/11/2017
OBSERVACIÓN DE LAS TINCIONES
Neutrófilo cayado o segmentado a 100x Neutrófilo polimorfo nuclear a 100X Linfocito 100x 40x
PRÁCTICA Nº8 17/11/2017
GRUPO SÉRICO
OBJETIVOS:
Determinar el grupo sanguíneo mediante la técnica del grupo sérico.
UTILIDAD CLÍNICA:
Por determinacion inversa se realiza el grupo serico, se usan hematies reactivos A y B para establecer la presencia o ausencia de anticuerpos Anti-A y Anti-B en el suero.
FUNDAMENTOS:
APARATAJE:
-Baño Maria
MATERIALES:
-Tubos de hemolisis de 3 ml.
-Suero.
REACTIVOS:
-Suspension de hematies al 2 % A1 -Suspensión de hematíes al 2% B.
PROCEDIMIENTO:
-Se introduce en el baño maría el suero para inactivarlo a 56ºC durante 30 minutos.
-Se rotulan dos dos tubos, uno con A1 y otro con B.
-A cada tubo se le añade dos gotas de suero inactivado.
-A continuación al tubo A1 con el suero se le añade suspensión de hematíes al 2% A1.
-Y al tubo B con el suero se le añade suspensión de hematíes al 2% B.
-Por ultimo, se centrifuga 1 o 2 minutos a 1000rpm.
-Cuando se haya centrifugado, agitar el tubo y determinar el grupo sanguíneo.
RESULTADOS:
No se observa aglutinación por lo que el grupo sanguíneo es AB.
OBSERVACIONES:
Los anticuerpos anti A y anti B sericos de la mayoría de los pacientes y donantes suelen ser demasiados debiles para aglutinar los glóbulos rojos sin centrifugacion o incubación prolongada por lo que son necesarios pruebas serologicas con métodos que detecten los anticuerpos en tubos, micro-placas o aglutinación en columna.
PRÁCTICA Nº9 22/11/2017
REVERSE GROUPING
OBJETIVOS:
Determinación de los grupos sanguíneos ABO/RH combinado con la prueba inversa o grupo serico.
UTILIDAD CLÍNICA:
La tarjeta ID-Card permite determinar el grupo hematico y el grupo serico para ABO, así como la determinación del antígeno RhD.
FUNDAMENTOS:
Los antígenos anti-A y anti-B son necesarios para determinar la presencia o ausencia de los antígenos A/B en hematíes humanos.
La determinación de los grupos sanguíneos ABO requiere la realización de una contraprueba serologica o grupo inverso con plasma o suero para confirmar los resultados obtenidos en la prueba hematica.
-Para la determinación del grupo ABO, se debe preparar una suspensión de hematíes al 5% de la siguiente manera:
1.Pipetear 0.5 ml de ID-Diluent 2 en un tubo.
2.Agregar 25 microlitros de concentrado de hematíes y mezclar.
-Se identifica la tarjeta con el nombre del donante o paciente.
-Se retira la lamina de sellado solo de los microtubos que se vayan a utilizar.
-Se pipetea 10 microlitros de suspensión de hematíes en los tubos A, B, D, C.
-Se pipetea 50 microlitros de plasma en los tubos A1 y B.(Sericos)
-Se pipetea 50 microlitros de Diacel 1 en el tubo A1 y 50 microlitros de Diacel 2 en el tubo B (Séricos).
-Sellar la tarjeta y centrifugar durante 10 minutos.
RESULTADOS:
El resultado es B+.
PRÁCTICA Nº10 24/11/2017
DETERMINAR EL FENOTIPO Y GENOTIPO MAS PROBABLE DEL GRUPO RH
OBJETIVOS:
Investigar el genotipo mas probable del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos sueros que contienen anticuerpos dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.
Centrifuga
MATERIALES:
-Material para lavado de hematies.
-Tubos de hemolisis.
-Pipetas pasteur y papel parafilm.
REACTIVOS:
-Anti-D
-Anti-C
-Anti-c
-Anti-E
-Anti-e
-Autocontrol D.
-SSF.
PROCEDIMIENTO:
-Realizar el lavado de hematíes de la muestra problema y una dilucion al 5% en SF.
-Rotular los 6 tubos con las letras C,D,c,E,e y CD.
-Depositar 2 gotas del anti-suero correspondiente y dos gotas de suspensión de hematíes problema.
-Tapar los tubos con parafilm y agitar.
-Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto.
-Resuspender el sedimento de los hematíes dando pequeños golpes en el fondo del tubo.
-Observar la presencia o ausencia de aglutinación.
RESULTADOS:
PRÁCTICA Nº11 27/11/2017
DETERMINAR EL FENOTIPO Y GENOTIPO MAS PROBABLE DEL GRUPO RH
OBJETIVOS:
Detectar la presencia de anticuerpos irregulares mediante las pruebas de salino inmediato y proteico inmediato.
UTILIDAD CLINICA:
El objetivo de esta práctica es enfrentar un suero problema con hematíes test de fenotipo conocido con objeto de detectar la presencia de anticuerpos en el suero, de los cuales se conocen con exactitud los antígenos presentes en su membrana, y aplicando técnicas de aglutinación salina y test de Coombs indirecto determinaremos dichos anticuerpos.
De este modo se detectan anticuerpos completos Ig M e incompletos Ig G.
FUNDAMENTOS: Los anticuerpos irregulares o aglutininas irregulares son anticuerpos anti glóbulos rojos. Están presentes en algunas personas que no tienen el antígeno correspondiente en la superficie de sus glóbulos rojos. Una persona Rh negativa no debería tener efectos anticuerpos anti-Rh. Su presencia es posible después de recibir una transfusión o después de dar a luz a un hijo Rh positivo. Su búsqueda es sistemática en el caso de transfusión de sangre y en mujeres embarazadas Rh- negativas para poder detectar una incompatibilidad materno fetal.
APARATAJE:
Centrifugadora:
Baño maria:
MATERIALES:
-Tubos de hemolisis.
-Pipetas automaticas y puntas de pipeta.
-Suspension de hematies al 2 %.
-Suero del paciente.
REACTIVOS:
-Albumina.
PROCEDIMIENTO -Añadimos a un tubo 2 gotas de suero problema + 2 gotas de los hematíes test.(Salino inmediato). Luego, incubamos a tª ambiente durante 30 minutos, mezclamos y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minutos. -Añadimos a otro tubo2 gotas del suero problema + 2 gotas de hematíes test + 2 gotas de albúmina. (Proteico inmediato). Luego, incubamos a37 ºCdurante 30 minutos, mezclamos y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minutos.
-Observamos la presencia de aglutinación en los tubos.La presencia de aglutinación indica un resultado positivo y el suero posee anticuerpos irregulares.
-Si en los tubos no se observa aglutinación hacemos unCoombspara detectar la presencia de anticuerpos. Para ello añadimos2 gotas de antiglobulinay centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto.
-Si observamos la presencia de aglutinación al realizar elCoombs, es un resultado positivo y significa que poseemos anticuerpos irregulares. En caso negativo nuestro suero problema no posee anticuerpos irregulares.
RESULTADOS:
Nuestro resultado ha sido negativo, es decir, al resuspender el botón hemático no hemos observado aglutinación alguna, por lo que el suero problema no posee anticuerpos irregulares..
PRÁCTICA Nº12 1/12/2017
PRUEBAS CRUZADAS
OBJETIVOS: El objetivo es detectar los posibles anticuerpos que se hallen fijados a la membrana de los hematíes con antiglobulina humana.
FUNDAMENTOS: Esta prueba sirve para determinar la compatibilidad sanguínea enfrentando el suero del receptor con los hematíes del donante. (Prueba cruzada mayor).
APARATAJE: -Centrifuga.
MATERIALES:
Pipetas
Centrifuga
Tubos de ensayo y gradilla
Vaso precipitado
REACTIVOS:
Antiglobulina humana
Suspensión de hematíes (donante)
Suero (receptor)
Solución salina fisiológica
Albúmina
PROCEDIMIENTOS: -En el primer tubo (tubo salino) añadimos2 gotas de suspensión de hematíes al 2% y 2 gotas del sueroe incubamos atª ambiente durante 30 minutos. -En elsegundo tubo (tubo proteico) añadimos2 gotas de suspensión de hematíes al 2%, 2 gotas del suero y 2 gotas de albúminae incubamos a 37 ºC durante 30 minutos.
-Transcurrido el tiempo centrifugamos los dos tubos a 1000 rpm durante 1 minuto.
-Si en el primer tubo (salino) hay aglutinación es que las dos muestras son incompatibles y si no existe aglutinación son compatibles.
-Si en el tubo proteico existe aglutinación la muestra no es compatible, pero si no existe aglutinación hay que confirmarlo, para ello:
-Lavamos 3 veces con solución salina y a continuación añadimos 2 gotas de antiglobulina (Coombs).
-Centrifugamos 1000 rpm durante 1 minuto y vemos el resultado.
-Si existe aglutinación las dos muestras son incompatibles y si no existe aglutinación son compatibles.
RESULTADOS:
Resuspendemos el botón hemático después de centrifugar y observamos la aglutinación.
Tubo salino después de centrifugarTubo proteico después de añadir el Coombs y centrifugar
Como se observa en la imagen no existe aglutinación en ningún tubo (los dos estaban iguales), lo que quiere decir las dos muestras son compatibles.
OBSERVACIONES: Pueden transfundirse sangre.
PRÁCTICA Nº13 15/12/2017
TARJETAS CON REACTIVOS DESHIDRATADOS PARA LA DETECCIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO
OBJETIVOS:
Determinacion del grupo sanguineo mediante tarjetas con reactivos deshidratados.
FUNDAMENTOS:
El test esta basado en la hemaglutinacion directa. Los anticuerpos reactivos secos presentes en la tarjeta aglutinarian los eritrocitos con los correspodientes antigenos. La falta de aglutinacion en un campo indica la ausencia del antigeno correspondiente.
El grupo sanguineo del individuo al cual se le realiza el test se determina a partir del patron de aglutinacion en la Eldon Card.
REACTIVOS:
-El campo azul anti-A contiene Ig-M monoclonal murina anti-A de la linea celular Birma-1.
-El campo anti-B contiene Ig-M monoclonal murina anti-B de la linea LB-2.
-El campo anti-D contiene Ig-M humano anti-D de la linea Ms-201.
-El campo control no contiene anticuerpos, pero si el mismmo PBS que los otros campos y un colorante azul.
MATERIALES:
-Agua destilada.
-Tarjeta ELDON DOCTOR KIT DKS 2511.
-Sangre capilar.
PROCEDIMIENTO:
-Rellenar los datos del paciente al que va ha realizar el analisis.
-Aplique una gota de agua dentro de cada area reactiva coloreada utilizando una pipeta.
-Desinfecte la zona del dedod donde va a realizar la puncion y deje secar al aire el dedo.
-Realice la puncion presionando la lanceta firmemente sobre la punta del dedo en la cara que se encuentre en direccion al dedo meñique.
-Masajee suavemente el dedo donde se realizo la puncion con el fin de obtener una gota de sangre. Recoja la gota de sangre sobre un EldonStick el cual aproximira por debajo de la gota del dedo.
-Mezclar las sangre en los circulos con la gota de agua y esperar a que el reactivo se disuelva.
-Extender la sangre por todo el circulo.
-Para desarrollar aglutinacion la tarjeta debe rotar durante unos 40 segundos.
-Los resultados se leen al momento.
-Si queremos conservar la tarjeta con los resultados, la dejamos secar sobre una superficie.
RESULTADO:
El resultado es A+, aunque el Anti-D no se puede apreciar mucho
-Si observamos la presencia de aglutinación al realizar el Coombs, es un resultado positivo y significa que poseemos anticuerpos irregulares. En caso negativo nuestro suero problema no posee anticuerpos irregulares.
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